Grazie al materiale raccolto e i dati preliminari prodotti durante gli anni passati, con il contributo della Fondazione Martalive, abbiamo potuto presentare un nuovo progetto di ricerca, prosecuzione di quello finanziato dalla Fondazione Martalive, al bando Progetti di Ricerca di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN 2022) del Ministero dell'Università e della Ricerca. Il progetto è stato approvato a giugno 2023 e finanziato a partire da qualche mese dopo.
Dal punto di vista burocratico, è stato necessario che i Comitati Etici dei centri coinvolti nello studio (a cui si è aggiunta l'Azienda Ospedaliero-Universitaria Senese) approvassero il nuovo protocollo di studio e che i centri approvassero l'utilizzo dei materiali e dati conservati presso la Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori di Milano (dove aveva preso il via lo studio) presso l'Istituto di Tecnologie Biomediche del CNR (attuale sede lavorativa della Dr.ssa Colombo).

Questi passaggi hanno richiesto qualche mese, ma a gennaio di quest'anno è ripreso l'arruolamento dei pazienti e sono proseguite le attività sperimentali.
All'agosto 2024 erano stati inseriti nello studio 170 pazienti e per 166 di essi è già stata effettuata la genotipizzazione e i dati di 152 di questi hanno superato i controlli di qualità. Due terzi questi sono di sesso maschile. L'età mediana dei pazienti al momento dell'arruolamento è di 72 anni. Più dell'80% dei pazienti è, o è stato, fumatore. Circa il 58% dei pazienti ha un ECOG performance status pari a 0 (ovvero sono attivi e senza analgesici). Meno di un decimo dei pazienti ha comorbidità autoimmuni.

Il sottotipo istologico maggiormente rappresentato, come atteso, è l'adenocarcinoma e il 90% dei pazienti ha un tumore di stadio 3 o 4. Poco più della metà dei pazienti ha un'elevata espressione tumorale della proteina PD-L1 (uno dei principali attori degli immune checkpoint e biomarcatore di risposta all'immunoterapia). Un terzo dei pazienti non è mai stato sottoposto né a chemio né a radioterapia, prima dell'attuale trattamento con ICI. Circa il 52% dei pazienti è stata trattata con pembrolizumab, il 28% con nuvolumab e il restante 20% con atezolizumab.

Di tutti i pazienti abbiamo raccolto le informazioni relative alla risposta all'immunoterapia, sia in termini di regressione/progressione della malattia, che in termini di insorgenza di effetti collaterali immuno-correlati. Il tempo di follow-up mediano è di 21 mesi (con un range tra 0,26 e 84 mesi). A 2 anni dall'inizio dell'immunoterapia, il 54% dei pazienti è andato incontro a progressione della malattia e il 40% è deceduto. Il 55% dei pazienti ha sviluppato almeno un evento avverso (di qualsiasi grado); il 26% ha sviluppato tossicità in più di un organo e circa l'11% dei pazienti ha sviluppato un evento avverso di grado pari o superiore a 3.

Il dato relativo agli eventi avversi non è stato raccolto per circa il 20% dei pazienti. Nella nostra casistica, abbiamo potuto osservare che i pazienti che hanno iniziato l'immunoterapia in uno stato di salute peggiore hanno avuto un tasso di mortalità maggiore, così come i pazienti che avevano una bassa espressione di PD-L1 nel loro tessuto tumorale (a conferma del ruolo dell'espressione di PD-L1 come marcatore prognostico positivo per il trattamento con immunoterapia). Inoltre abbiamo visto che i pazienti trattati con atezolizumab hanno avuto una sopravvivenza inferiore rispetto a quelli trattati con gli altri due farmaci.

Figura 1 - Curve di Kaplan-Meier che descrivono l'andamento della probabilità di sopravvivenza dei 152 pazienti in studio, a seconda del performance status, dell'espressione di PD-L1 e del farmaco somministrato.

Nei mesi scorsi abbiamo iniziato a condurre le analisi genetiche previste. In particolare, i risultati dell'analisi volta ad individuare varianti genetiche, lungo tutto il genoma, associate alla sopravvivenza dei pazienti in seguito a 2 anni di immunoterapia, ci indicano che una regione sul cromosoma 2 potrebbe avere un ruolo nel predisporre i pazienti ad una peggiore risposta al trattamento con ICI.

Nei mesi scorsi abbiamo iniziato a condurre le analisi genetiche previste. In particolare, i risultati dell'analisi volta ad individuare varianti genetiche, lungo tutto il genoma, associate alla sopravvivenza dei pazienti in seguito a 2 anni di immunoterapia, ci indicano che una regione sul cromosoma 2 potrebbe avere un ruolo nel predisporre i pazienti ad una peggiore risposta al trattamento con ICI.

Figura 2 - Risultati dell'analisi di associazione con la sopravvivenza, lungo tutto il genoma.
Ogni pallino rappresenta una variante genetica, il cui livello di associazione è misurato sull'asse y. In giallo la regione più interessante, sul cromosoma 2. Infatti, varianti in porzioni non codificanti del genoma, ma vicini ai geni MSH6 e FBXO11, sono risultate associate ad una più alta probabilità di morte entro 24 mesi dall'inizio dell'immunoterapia.

Ogni pallino rappresenta una variante genetica, il cui livello di associazione è misurato sull'asse y. In giallo la regione più interessante, sul cromosoma 2. Infatti, varianti in porzioni non codificanti del genoma, ma vicini ai geni MSH6 e FBXO11, sono risultate associate ad una più alta probabilità di morte entro 24 mesi dall'inizio dell'immunoterapia.

Figura 3 - Dettaglio della regione sul cromosoma 2 con la più alta associazione con la sopravvivenza dei pazienti.

Ogni pallino rappresenta una variante genetica, mentre le linee al di sotto rappresentano i geni. I colori dei pallini indicano la correlazione delle varianti con quella più significativa (in viola).
I geni nella regione identificata sono già stati riportati come coinvolti nella tumorigenesi, ed in particolare l'espressione del gene MSH6, implicato nei meccanismi di riparazione dei danni al DNA, è anche già stata riportata come possibile marcatore di risposta all'immunoterapia. È interessante notare che le varianti identificate sono in grado di modulare l'espressione dei due suddetti geni e, pertanto, ulteriori indagini funzionali saranno utili per delucidare il meccanismo biologico alla base dell'associazione genetica osservata.
In modo simile, stiamo conducendo delle analisi per identificare varianti associate alla sopravvivenza libera da progressione, un altro modo di valutare l'efficacia della terapia con ICI, e associate all'insorgenza di effetti collaterali.
Prevediamo di preparare entro la fine del 2024 un articolo, con i risultati di queste analisi, da inviare ad una rivista scientifica. Inoltre, a settembre procederemo con la preparazione delle librerie di RNA-Seq per l'analisi del trascrittoma, ovvero di tutto ciò che è espresso nelle cellule del sangue dei pazienti prelevati in tre tempi: prima dell'inizio dell'immunoterapia, alla prima visita di controllo e, ove possibile, alla progressione della malattia o alla sospensione del trattamento. Questa ulteriore analisi ci permetterà di identificare degli altri marcatori di risposta agli ICI e di condurre analisi che integrino i dati genetici e i dati di espressione per comprendere meglio, dal punto di vista funzionale, il ruolo degli elementi genetici identificati.
Dr.ssa Francesca Colombo - Istituto di Tecnologie Biomediche - CNR Milano